骨組織消化手冊

更新時(shí)間：2016-02-17

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Worthington組織消化指南

引言

組織消化酶主要用于組織培養(yǎng)和細(xì)胞生物學(xué)研究的原代細(xì)胞的分離和收集。盡管這些消化酶已經(jīng)普遍應(yīng)用多年，但是對其組織消化和細(xì)胞收集的作用機(jī)制卻沒有全面的理解。由此導(dǎo)致的結(jié)果便是選擇一種消化方法大多是隨機(jī)選擇或基于過去的經(jīng)驗(yàn)，而不是在*理解消化原理的基礎(chǔ)上選擇的消化方案，以及如何根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)?zāi)康男拚桨敢垣@得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

細(xì)胞分離程序的目的是zui大程度的獲得功能活性的單個(gè)細(xì)胞，而影響結(jié)果的原因有很多，包括（不限于）以下：

1、組織類型

2、物種來源

3、動(dòng)物年齡

4、遺傳改造情況（如knockouts）

5、所用的消化培養(yǎng)液

6、所用的酶

7、消化酶中的雜質(zhì)

8、所用消化酶的工作濃度

9、溫度

10、孵育時(shí)間

通常前四個(gè)原因沒辦法選擇，而剩下的原因一般由經(jīng)驗(yàn)決定以獲取zui適實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

通過查閱文獻(xiàn)來選擇*組織消化酶和zui適消化條件的研究人員通常被互相矛盾的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)搞得一頭霧水。這些巨大差異來源于組織胞外基質(zhì)的復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的特性，以及過去常用的粗制、未提純的組織分離酶。另外，組織胞外基質(zhì)由各種蛋白、糖蛋白、脂類和糖脂組成，這些成分的組成比例在不同物種、不同組織、甚至不同發(fā)育（年齡）之間存在明顯的差異，這些因素都極大的影響了消化方案的制定。目前通常使用的粗制酶，如鏈霉蛋白酶、NF1:250、以及含有幾種其他不同濃度蛋白酶的膠原酶、以及各種多糖酶、核酶和脂酶。

本指南總結(jié)了目前常用組織消化酶的zui適消化和細(xì)胞收集知識(shí)和方法，描述了標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)步驟，以便于制定一個(gè)*的細(xì)胞分離方案，同時(shí)列舉了一些相關(guān)的參考文獻(xiàn)。

下表列出多種組織的適宜消化酶（含參考文獻(xiàn)，以組織類型和物種分類，詳見鏈接）

脂肪組織	腎上腺組織	骨組織	腦組織
軟骨組織	結(jié)腸組織	內(nèi)皮組織	上皮組織
眼	心臟	腸	腎
肝	肺	淋巴結(jié)	乳腺
其它組織	其他組織	肌組織	神經(jīng)組織
胰腺	腮腺	垂體	前列腺
生殖	動(dòng)物鱗片	皮膚	脾臟
干細(xì)胞	胸腺	甲狀腺/甲狀旁腺	扁桃體
腫瘤

注：使用Worthington公司消化酶的文獻(xiàn)不限于上表鏈接中所列，一般而言，Worthington公司的組織消化酶可用于大多組織類型的消化。

骨組織消化手冊

物種	詳細(xì)來源	細(xì)胞名稱	消化用酶	培養(yǎng)基	參考文獻(xiàn)
牛	牛	Chondrocytes	Collagenase Type 2: 0.4%	DMEM	Buschmann, M., Gluzband, Y., Grodzinsky, A., and Hunziker, E.: Mechanical Compression Modulates Matrix Biosynthesis in Chondrocyte/Agarose Culture, J Cell Sci 108, 1497, 1995
雞	日齡小雞	Osteoblasts	Trypsin: 0.03%	DMEM	Gay, C., Lloyd, Q., and Gilman, V.: Characteristics and Culture of Osteoblasts Derived From Avian Long Bone, In Vitro Cell Dev Biol 30A, 379, 1994
雞	小雞, 彼得森/喬木英畝, 雄性, 4 周老(家雞)	Chondrocytes	Trypsin: 0.25%	Ham's F12	Rosselot, G., Reginato, A.M., and Leach, R.M.: Development of a Serum-Free System to Study the Effect of Growth Hormone and Insulinlike Growth Factor-1 on Cultured Postembryonic Growth Plate Chondrocytes, In Vitro Cell Dev Biol 28A, 235, 1992
雞	小雞, 胚胎	Vertebrae chondroblasts	Trypsin: 0.25%	Simm's, CMF	Schiltz, J.R., Mayne R., and Holtzer, H.: The Synthesis of Collagen and Glycosaminoglycans by Dedifferentiated Chondroblasts in Culture, Differentiation 1, 97, 1973
人類	人類, 22-73 歲	Osteoblasts	Trypsin: 0.5%	Basal Medium	Kneser U, Voogd A, Ohnolz J, Buettner O, Stangenberg L, Zhang YH, Stark GB, Schaefer DJ:Fibrin gel-immobilized primary osteoblasts in calcium phosphate bone cement: in vivo evaluation with regard to application as injectable biological bone substitute, Cells Tissues Organs 179, 158-69, 2005
人類	人類, 60歲以上	Bone Cells, Osteoblasts	Collagenase Type 2: 200-250 u/ml	DMEM	Chen X., Qian H., Neff L., Satomura K., and Horowitz M.: Thy-1 antigen Expression by Cells in the Osteoblast Lineage, J Bone Miner Res 14, 362, 1999
人類	人類	Osteoblasts	Trypsin: 0.1%	DMEM	Meikle, M., Boyd, S., Hembry, R., Compston, J., Croucher, P., and Reynolds, J.: 人類 Osteoblasts in Culture Synthesize Collagenase and Other Matrix Metalloproteinases in Response to Osteotropic Hormones and Cytokines, J Cell Sci 103, 1093, 1992
人類	人類	Osteoblasts	Collagenase Type 4: 250 u/ml	DMEM	Fedarko, N.S., Termine, J.D., Young, M.F. and Robey, P.G.: Temporal Regulation of Hyaluronan and Proteoglycan Metabolism by 人類 Bone Cells in Vitro, J Biol Chem 265, 12200, 1990
小鼠	小鼠	Bone Stromal cells	Collagenase Type 1: 0.3%	DMEM	Igarashi, H., Akahoshi, N., Ohto-Nakanishi, T., Yasuda, D. and Ishii, S.: The Lysophosphatidic Acid Receptor LPA4 Regulates Hematopoiesis-Supporting Activity of Bone Marrow Stromal Cells.,Sci Rep 5, 11410, 2015
小鼠	小鼠	Osteoblasts	Collagenase Type 1: 1.0%	MEM	Lee, D., Choung, H., Kim, H., Gronostajski, R., Yang, Y., Ryoo, H., Lee, Z., Kim, H., Cho, E. and Park, J.: NFI-C Regulates Osteoblast Differentiation Via Control of Osterix Expression., Stem Cells 32, 2467-79, 2014
小鼠	小鼠	Osteoblasts	Neutral Protease: 1.6%	MEM
小鼠	小鼠, 4-22 月	Osteocytes	Collagenase Type 1: 300 u/ml	MEM	Stern, A., Stern, M., Van Dyke, M., Jahn, K., Prideaux, M. and Bonewald, L.: Isolation and Culture of Primary Osteocytes from the Long Bones of Skeletally Mature and Aged Mice.,Biotechniques 52, 361, 2012
小鼠	小鼠	Endosteal cells	Collagenase Type 1: 0.3%	DMEM	Nakamura, Y., Arai, F., Iwasaki, H., Hosokawa, K., Kobayashi, I., Gomei, Y., Matsumoto, Y., Yoshihara, H. and Suda, T.: Isolation and Characterization of Endosteal Niche Cell Populations that Regulate Hematopoietic Stem Cells., Blood 116, 1422, 2010
小鼠	小鼠	Bone marrow	Collagenase: 0.2%	DMEM	Morikawa, S., Mabuchi, Y., Kubota, Y., Nagai, Y., Niibe, K., Hi大鼠su, E., Suzuki, S., Miyauchi-Hara, C., Nagoshi, N., Sunabori, T., Shimmura, S., Miyawaki, A., Nakagawa, T., Suda, T., Okano, H. and Matsuzaki, Y.: Prospective Identification, Isolation, and Systemic Transplantation of Multipotent Mesenchymal Stem Cells in Murine Bone Marrow., J Exp Med 206, 2483-96, 2009
小鼠	小鼠, male, 6-8 week old	Osteoclasts	Collagenase Type 3: 0.1%	DMEM	Sakai, E., Miyamoto, H., Okamoto, K., Kato, Y., Yamamoto, K., and Sakai, H.: Characterization of Phagosomal Subpopulations Along Endocytic Routes in Osteoclasts and Macrophages, J. Biochem. 130, 823, 2001
小鼠	小鼠, 3-5 天, 6-8 周	Bone Cells, Osteoblasts	Collagenase Type 2: 200-250 u/ml	DMEM	Chen X., Qian H., Neff L., Satomura K., and Horowitz M.: Thy-1 antigen Expression by Cells in the Osteoblast Lineage, J Bone Miner Res 14, 362, 1999
小鼠	小鼠, 白變種實(shí)驗(yàn)室老鼠	Osteoblast-like Cells	Trypsin: 0.1%	Eagle's MEM	Takanashi, H., Matsuishi, T., and Yoshizato, K.: Establishment and Characterization of Stromal Cell Lines That Support Differentiation of Murine Hematopoietic Blast Cells into Osteoblast-like Cells, In Vitro Cell Dev Biol 30A, 384, 1994
		Stromal Cell Lines
		Hematopoietic Blast Cells
小鼠	小鼠, 遠(yuǎn)交群小鼠	Neonatal bone	Collagenase Type 2: 0.20%	Tris-buffered saline	Chen,T. and Feldman,D.: Regulation of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Receptors in Cultured 小鼠 Bone Cells, J Biol Chem 256, 5561, 1981
大鼠	大鼠,胎兒, 21 妊娠日	Calvaria	Collagenase: 0.2%	MEM	Owen, T., Aronow, M., Shalhoub, V., Barone, L., Wilming, L., Tassinari, M., Kennedy, M., Pockwinse, S., Lian, J., and Stein, G.: Progressive Development of the 大鼠 Oseoblast Phenotype In Vitro: Reciprocal Relationships in Expression of Genes Associated with Osteoblast Prolife大鼠ion and Differentiation During Formation of the Bone Extracellular Matrix, J Cell Physiol143, 420, 1990
大鼠	大鼠, 初生	Osteoblastlike cells	Collagenase Type 2: 0.3%	MEM	Ernst, M., and Froesch, E.: Osteoblastlike Cells in a Serum-Free Methylcellulose Medium Form Colonies: Effects of Insulin and Insulinlike Growth Factor I, Calcif Tissue Int 40, 27, 1987
大鼠	大鼠, 胎兒, 17-21 天	Calvaria	Collagenase: 0.01%-0.6%	Tris-buffered saline	Peck, W., Birge, S., and Fedak, S.: Bone Cells: Biochemical and Biological Studies After Enzymatic Isolation, Science 146, 1476, 1964

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