arthusbio IK00301s說明書

S- Adenosyl-L-Homocysteine (SAH) ELISA Kit

(For Plasma, Serum or Tissue Samples)

目錄號IK00301s

包裝尺寸96測試

檢測范圍31.25 nM-1000 nM

目標(biāo)詳細(xì)信息

甲硫氨酸是一種具有硫甲基的氨基酸，通過甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶（EC 2.5.1.6）與ATP一起轉(zhuǎn)化為S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。SAM是50多種生物活性物質(zhì)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、磷脂、激素和神經(jīng)遞質(zhì)等）的甲基供體。甲基在甲基轉(zhuǎn)移酶作用下從SAM轉(zhuǎn)移后，形成S-腺苷高半胱氨酸，去除腺苷后進(jìn)一步代謝為同型半胱氨酸（Hcy）。同型半胱氨酸通過N5甲基四氫葉酸甲基轉(zhuǎn)移酶（EC1.1.1.68）和輔酶維生素B12催化途徑從N5甲基四氫葉酸接受甲硫氨酸代謝為甲硫氨酸。這是蛋氨酸循環(huán)。

甲基化指數(shù)定義為SAM和SAH的比率。甲基化指數(shù)是甲基化狀態(tài)和甲基化的更好標(biāo)記

能力。

SAH和Hey連接了向關(guān)鍵生物分子提供甲基乙氧基和從N-5甲基四氫葉酸中回收甲基乙氧基的過程。蛛網(wǎng)膜下腔出血的水平將決定或反映蛋氨酸循環(huán)是否正常。因此，找到一種更好地量化它們的方法具有重要的實(shí)際意義。SAH升高可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，這與基因組甲基化水平有關(guān)。蛛網(wǎng)膜下腔出血可能是動脈粥樣硬化的潛在生物標(biāo)志物。該免疫分析試劑盒用于測量可溶性樣本中的SAH水平。

測定原理

這種直接競爭ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）旨在測量樣品中S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAH）的水平。將與大分子共軛的SAH固定在

微量滴定板。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品移液到孔中，然后添加抗SAH的HRP結(jié)合抗體。樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的游離SAH分子與微滴度板表面上的固定化SAH競爭抗體的結(jié)合位點(diǎn)。丟棄混合溶液并清洗每個(gè)孔后，添加TMB基質(zhì)溶液。基質(zhì)溶液在HRP（辣根過氧化物酶）的作用下變藍(lán)，添加停止溶液（酸）后變黃。顏色與樣品（或標(biāo)準(zhǔn)品）中的SAH量成反比。使用微板分光光度計(jì)在450nm處測量剩余溶液（OD450）的光密度。可以通過標(biāo)準(zhǔn)生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中的SAH水平。

樣品收集和儲存

1、樣品采集必須在4°C下進(jìn)行。必要時(shí)，通過離心去除沉淀，并盡快測試樣品或?qū)⑵鋬Υ嬖?20°C或以下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

2.避免樣品中的NaN3，因?yàn)樗鼤估备^氧化物酶（HRP）失活。

3、試劑盒用于血漿、血清或組織/細(xì)胞勻漿樣品。

程序

1、將所有試劑重新加熱至室溫，并充分混合。取出適當(dāng)數(shù)量的井，將剩余的井放回Ziploc。密封Ziploc并將其儲存在-20°C。

2、向每個(gè)孔中加入50ul樣品稀釋劑（空白孔）、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。

3、制備HRP結(jié)合抗體溶液：用HRP抗體稀釋液按1:500稀釋HRP抗體，一周內(nèi)用完。如果一周后使用，請?jiān)谛枰獣r(shí)準(zhǔn)備。充分混合并儲存在黑暗中。

4、向每個(gè)孔中加入50ul HRP結(jié)合抗體，空白孔除外。

5、將平板置于振蕩器上，搖動一段時(shí)間，使試劑混合，然后用微孔板封閉劑密封平板。將平板在37°C下培養(yǎng)1小時(shí)。

6、小心剝離密封劑，并將剩余溶液丟棄在孔中。在每個(gè)孔中添加至少300ul洗滌液，并保持該狀態(tài)30秒，然后去除洗滌液。重復(fù)這些步驟3次以完成清洗過程。或者改用自動清洗機(jī)。

7、向每個(gè)孔中添加TMB基質(zhì)和100ul混合基質(zhì)。輕輕搖晃并密封盤子。將培養(yǎng)板在37°C下無光培養(yǎng)15分鐘。

8、在反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入50ul停止溶液。

9.在15分鐘內(nèi)測量每個(gè)孔在450 nm波長下的吸光度。根據(jù)空白井設(shè)置零。

數(shù)據(jù)處理

始終通過從測試孔的吸光度中減去空白孔450 nm（OD450）處的吸光度來清除背景。每個(gè)孔（標(biāo)準(zhǔn)或樣品）的吸收率等于A/Aso，A是標(biāo)準(zhǔn)孔或樣品孔的平均吸光度，Aso是S0標(biāo)準(zhǔn)孔的平均吸光度。創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)

通過繪制每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品在y軸上的結(jié)合率與

其濃度在x軸上的對數(shù)。使用二次多項(xiàng)式曲線擬合數(shù)據(jù)（r>0.99）。通過將樣品的結(jié)合速率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，可以計(jì)算樣品的SAH水平。如果樣品已稀釋，則乘以稀釋程度。

筆記

1、使用未重新加熱的試劑和樣品或環(huán)境溫度低于20°C可能導(dǎo)致OD450值降低。

2、額外的干燥后洗滌可能會對結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響，例如標(biāo)準(zhǔn)曲線和重復(fù)性較差。為了避免這種情況，請?jiān)谇逑春罅⒓磮?zhí)行下一步。

3、充分混合溶液并*清洗，因?yàn)檫@些程序會影響分析。

4、用微板封閉劑密封板，孵育板時(shí)避光。

5、推薦標(biāo)準(zhǔn)和樣品的重復(fù)井，建議標(biāo)準(zhǔn)曲線ftting采用二次多項(xiàng)式（>0.99）。質(zhì)控瓶的檢測濃度應(yīng)在檢測范圍內(nèi)。

6、濃縮洗滌液可能結(jié)晶。加熱，使鹽在稀釋前*溶解。

7、微孔板密封劑應(yīng)一次性使用，以避免交叉污染。

8、基板應(yīng)避光。

9、停止溶液為稀硫酸。避免直接接觸皮膚和其他物品。

存儲和有效日期

儲存條件：除HRP基質(zhì)和停止溶液儲存在2-8°C外，所有其他成分和板條均可冷凍儲存。

有效期：自裝運(yùn)之日起冰箱儲存約6個(gè)月。如果不打算很快使用，用戶可以將分析板、HRP抗SAM抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP抗體和樣品稀釋液放在冷凍柜中，以獲得更長的儲存時(shí)間或/或更好的結(jié)果。